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拟南芥AFP4的克隆、原核表达和纯化及其与ABI5的互作

作者: 邓子兵 邱梁堃 马建忠

关键词: 拟南芥 AFP4 原核表达 Westernblot 酵母双杂交 ABI5

摘要:拟南芥ABI5相互作用蛋白AFP4(ABI five binding protein 4)是植物中的一个小分子蛋白,其表达特性与ABI5相似,受ABA诱导.以拟南芥Arabidopsis thaliana L.(Heyn)cv.Columbia为材料,通过PCR扩增了AFP4基因的完整编码序列.扩增片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间和酵母双杂交载体pGBKT7的多克隆位点EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点之间.将ABI5基因的编码序列插入到酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点之间.重组质粒测序结果表明,所克隆的AFP4和ABI5编码区序列分别与NCBI数据库收录的AFP4基因(GenBank登录号NM 111081.2)和ABI5基因(GenBank登录号NM 129185.3)完全一致.重组原核表达载体含有AFP4片段的重组融合蛋白的理论分子量为53.4 ku.将重组质粒转化至大肠埃希菌表达菌株BL21 Star(DE3)中诱导表达,并经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.将含有AFP4和ABI5的酵母双杂交重组质粒共同转化酿酒酵母AH109中进行酵母双杂交.结果表明,重组融合蛋白在大肠埃希菌E.coli BL21 Star(DE3)中表达的适宜条件为:IPTG浓度为0.4 mmol·L-1、25℃下诱导表达6 h.在上述条件下,重组融合蛋白占细胞破碎后上清液总蛋白的41.6%.经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,AFP4融合蛋白在SDS-PAGE分析时呈现单一条带.该条带经过抗6xHis标签肽的抗体分析,呈阳性.该条带经酵母双杂交分析结果表明,AFP4和ABI5在酵母细胞中可以相互作用.


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